A. Pengertian Elektroforesis
Banyak molekul biologis seperti asam amino, peptida, protein, nukleotida dan asam-asam nukleat memiliki gugus yang dapat engion sehingga bermuatan listrik, baik sebagai kation (+) atau anion (-). Bahkan senyawa yang non polar seperti karbohidrat dapat diberi muatan dengan derivatisasi misalnya sebagai senyawa fasfat.
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan lisrtik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat di deteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negative dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatanya. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Pergerakan ini disebut elektroforesis. Jika sistem koloid bermuatan negative, maka partikel itu akan menuju elektrode positif
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:
Fe = qE
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.
Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.
Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai.
B. Jenis Elektroforesis
1. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut. 2. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media. C. Medium Pendukung
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan medium pendukung untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan medium pendukung yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Efek penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis dilakukan di medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan buffer. Pemisahan sempurna suatu campuran dapat terjadi efektif dalam zona tertentu.
Meskipun medium pendukung relatif stabil (inert), komposisinya mungkin akan menyebabkan penyerapan, migrasi elektron (elektro osmosis) atau penyaringan berdasarkan ukuran molekulnya, yang kesemuanya mempengaruhi kecepatan gerak senyawa.
1. Cellulose asetat
Bahan ini menunjukan penyerapan minimal dan pemisahan yang jelas dari campuran dalam zona yang terpisah jelas. Oleh karena itu, komponen mudah dipisahkan dengan hasil yang baik. Bahan dengan jumlah sangat kecil memerlukan waktu pemisahan sempurna hanya satu jam, dibandingkan dengan elektroforesis kertas yang memerlukan waktu 1 malam.
Selulosa asetat kurang suka air daripada kertas sehingga buffer yang diserap juga lebih sedikit, sehingga pemisahan lebih baikdalam waktu lebih pendek. Dengan sedikitnya buffer yang terikat dalam keadaan arus tetap atau voltase tetap, akan terjadi panas yang lebih banyak.
Keuntungan lain adalah selulosa asetat tembus cahaya sehingga setelah pemisahan, dan pengecatan dapat dicuci dengan pembersih. Selulosa lebih sering dipakai untuk pemisahan protein darah termasuk glikoprotein, lipoprotein dan hemoglobin.
2. Larutan Buffer
Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung. Buffer juga dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal, yaitu :
- Komposisi
Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan mempengaruhi kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk memisahkan karbohidrat, karena dapat membentuk gabungan yang bermuatan listrik dengan karbohidrat.
- Konsentrasi
Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang terbawa meningkat dan bagian aliran yang dibawa sampel menurun, sehingga memperlambat geraknya. Kekuatan ion tinggi dalam buffer akan meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas juga meningkat, biasanya dipilih 0,05 -0,10M.
- pH
Tingkat ionisasi asam-asam organik akan bertambah apabila pH bertambah, sebaliknya untuk basa-basa organik,oleh sebab itu tingkat kecepatan geraknya juga terpengaruh oleh pH. Kedua pengaruh dapat terjadi pada senyawa seperti asam aminoyang memiliki sifat asam dan basa.
3. Medan elektrik
Apabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus ditentukan oleh tahanan dalam medium.
- Voltase
Apabila jarak antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan potensial antara keduanya adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m. Kenaikan gradient potensial akan menyebabkan kecepatan gerak ion.
- Aliran listrik
Arus aliran listrik dalam larutan antara dua elektroda disebabkan umumnya oleh ion buffer dan sedikit oleh ion dalam sampel. Kenaikan voltase akan meningkatkan jumlah muatan yang dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang ditempuh ion akan sebanding dengan waktunya.
- Tahanan
Medium elektroforesa menimbulkan pada aliran ion sebanding dengan jenis medium, jenis buffer dan konsentrasinya. Tahanan akan meningkat dengan bertambahnya jarak antara elektroda, namun berkurang dengan bertambahnya luas permukaan elektroda dan konsentrasi ion dalam buffer.
4. Peralatan Elektroforesis
Alat elektroforesis terdiri dari dua bagian, yaitu bagian tenaga listrik dan elektroforesa. Bagian tenaga listrik menyediakan arus listrik searah yang stabil dilengkapi pengatur voltase maupun arus. Voltase rendah meliputi keluaran 0-500 V dan 0-150 A dengan voltase konstan atau arus konstan. Bagian elektroforesa terdiri dari elektroda, cadangan buffer dan pendukung medium elektroforesa dan tutup tembus pandang. Elektroda dapat dari stainless steel, tetapi adanya buffer dapat menyebabkan kerak, maka elektroda platina lebih baik.
Dua wadah buffer masing-masing dibagi menjadi dua bagian yang saling berhubungan, satu tempat elektroda dan yang lain medium pendukung berhubungan dengan buffer. Ruang terpisah diperlukan supaya perubahan pH pada elektroda tidak mempengaruhi buffer yang menjenuhi medium.
5. Aplikasi
Elektroresis voltase rendah dapat digunakan untuk pemisahan molekul besar (BM > 1000) seperti peptide, protein dan asam nukleat. Pemisahan semalaman untuk komponen dengan berat molekul kecil sering memuaskan karena difusi berlebih, jadi komponen seperti asam amino lebih baik pada voltase tinggi.
Aplikasi elektroforesis banyak digunakan pada kesehatan dan Biokimia klinik, seperti analisa protein serum untuk mengetahui komponen yang abnormal dan perubahan rasio albumin dan globulin pada suatu penyakit.
