1. Preparasi sel/jaringan
Darah yangdigunakan leukositnya, eritrosit dilisiskan dan dibuang. Secepatnya diekstraksi untuk mendapat hasil optimal,leukosit disimpan sebaiknya pada suhu 4 derajat C, penyimpanan yang lama (> 1 bulan) akan menurunkan hasil ekstraksi, volume 3 � 5 ml whole blood.
Jaringan yang diambil secepatnya diekstraksi. Penyimpanan jaringan pada suhu -80 derajat. Jaringan yang disimpan dalam paraffin blok sulit untuk diekstraksi.
2. Lisis membran sel/organella (nukleus)
Senyawa yang digunakan untuk melisiskan membran yaitu Phenol : senyawa yang sangat kuat untuk melisiskan membran, tetapi toksik. Selain itu digunakan Guanidine isothicyanate : tidak toksik, digunakan sebagai pengganti phenol
3. Denaturasi senyawa organik
Untuk medenaturisasi protein yang ada digunakan senyawa Kloroform : paling banyak digunakan karena prosedur sederhana, murah, mudah diperoleh. Selain kloroform juga digunakan Proteinase K untuk denaturasi protein tetapi perlu inkubasi.
4. Presipitasi DNA
Digunakan senyawa Isopropanol dengan volume 1:1, atau Ethanol absolut dan sodium asetat 1:10
5. Pencucian/washing
Pencucian sisa senyawa mengunakan Ethanol 70%
Metode-metode yang digunakan dalam ekstraksi DNA
1. Phenol:chloroform
Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol
2. Salting Out
Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan Proteinase K untuk denaturasi protein
3. Guanidine isothiocyanate
Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis dinding sel , Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein.
4. Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi recovery DNA kurang.
Pengukuran kualitas DNA
Kualitas DNA yaitu utuh, tidak putus-putus, konsentrasinya tinggi dan tidak banyak terkontaminasi protein. Menentukan kualitas DNA dengan Spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm (protein 280 nm; DNA baik apabila pengukuran pada 260:280 = 1,7 � 1,9). Satu OD = 50 ng DNA. Dilihat dengan elektroforesis, band yang tebal secara kualitatif menunjukkan DNA yang bagus
Penyimpanan DNA
DNA disimpan dalam TE buffer (tris-hydroxymethyl amino methana � EDTA), Disimpan � 80 derajat bisa tahan bertahun-tahun. Untuk kerja, sebaiknya disiapkan DNA yang sudah diencerkan menjadi 100 ng/mikroliter. Freezing � thawing berulang dapat meyebabkan kerusakan DNA.
Demikian artikel tentang Prinsip Kerja dari Ekstraksi DNA ini dapat kami sampaikan, semoga artikel atau info tentang Prinsip Kerja dari Ekstraksi DNA ini, dapat bermanfaat. Jangan lupa dibagikan juga ya!
